这是第一次,研究人员已经解决了的分子结构LRRK2,帕金森氏和自身免疫性疾病的主要危险因素。结构生物学家在加州圣地亚哥大学,用创新的方法来提供分子的两个互补的观点。在8月7细胞,通过伊丽莎白别墅领导的研究描述全长,致病LRRK2内细胞的三维结构。蛋白质形成螺旋状围绕微管细丝。由安德烈Leschziner领导的研究中分离适于cryoEM野生型LRRK2的片段。在8月19日自然,他们的高分辨率分子图谱,发现该蛋白的这一部分折叠,以使其激酶和GTP酶结构域紧密接近。这一发现解释了以前的实验数据表明相互作用的两个领域。

  • 通过cryoimaging LRRK2,研究解决其三维结构。
  • 激酶和GTP酶结构域躺在并拢。
  • 致病突变增强微管结合,阻断货物运输。

通过数据两项研究相结合,研究小组确定了LRRK2绑定微管,其激酶必须是在一个封闭的,或主动,构象。致病突变,其中一些是已知的,以增加微管结合,出现以偏置朝向该形状的分子。Leschziner和同事的数据暗示,微管结合有助于毒性,因为LRRK2丝妨碍马达蛋白的通道下,这些高速公路,可能造成交通拥堵。

LRRK2激酶抑制剂目前正在测试作为PD治疗剂也可以在陷阱此闭合构象的蛋白。

微管装饰。LRRK2(黑色边框)的单体联合起来,形成的链(金色和蓝色)围绕微管那套(灰色)双螺旋。向下观察微管轴,各单体假定相对于所述微管表面(底部)相同的取向。[礼貌Watanabe等人,Cell的。]

“在这两个优雅的研究中所描述的新的结构在我们的LRRK2的理解代表了显著的一步,”达里奥阿莱西在苏格兰邓迪大学,写信给Alzforum(低于满注释)。“这些数据通过促进LRRK2采取封闭构象是能结合微管细丝提供新的见解如何致病突变可能发挥自己的作用。”

在偷看他们的自然栖息地3 d结构
在LRRK2突变占最多的家族性PD病例的10%。此外,该蛋白的浓度升高在散发性疾病的许多情况下,在病理学(一个广泛作用暗示二马尤等人,2018)。然而,如何LRRK2有助于帕金森氏一直保持低迷。除了是一个激酶和GTP酶,这种大蛋白含有许多其他蛋白质相互作用结构域(参见下图)。LRRK2参与许多细胞过程,包括囊泡运输,细胞信号传导,和自噬,促使假设的大量有关它如何可能会造成伤害(2012年10月新闻;2013年3月新闻发布会)。蛋白质的结构图可以帮助研究人员破译它的功能,但尽管经过了多年的努力,已LRRK2抵制顽固结晶。

比利亚和他的同事决定翻转映射LRRK2的挑战上发挥得淋漓尽致。而不是试图净化和结晶蛋白质,他们的理由,为什么不干脆像它在的地方?他们注意到一个事实,即致病LRRK2被称为装饰微管的优点,使得它很容易找到,细胞内的可视化。联合第一作者渡边丽香,罗伯特Buschauer,和JanBöhning表示荧光标记的LRRK2轴承PD突变I2020T在肾细胞系,愣细胞,切块他们到薄切片,和位于LRRK2微管通过光学和电子显微镜相关。然后,他们倾斜以不同的角度部分和成像这些装饰微管在被称为低温电子断层扫描的处理的电子显微镜。CryoET构建三维结构从表面上的连续的二维图像(卢奇克等人,2008年)。有了这项技术,作者映射的微管结合LRRK2细丝的14埃的分辨率。

臭名昭著的多任务。除了复杂的(ROC)GTP酶(绿色)的RAS和激酶结构域(粉红色),LRRK2含有许多蛋白质 - 蛋白质相互作用结构域。C末端ROC(COR)N和C结构域的调节GTP酶。这些通常被称为COR-A(黄色)和COR-B(橙色)。[礼貌Watanabe等人,Cell的。]

“据我所知,这是第一次有人已经解决了在电池内部结构,然后才能与生物化学得到解决,”比利亚说。“我们采取了技术上看上而是生化偷懒的做法。”

CryoET揭示LRRK2分子形成围绕每个微管具有双螺旋,就像一个棒棒糖的螺旋条纹(参照图像在顶部)。在LRRK2蛋白的这些长菊花链中,每个通过各自的WD40域(是的,这里WD40是胶水,不是润滑剂),并分别通过各自的COR-B结构域的一个在其前面结合到其后面的一个。将蛋白定向成使得它们的C-末端半部分,同时含有催化结构域,分别位于微管表面附近,而其N末端部分浮起到细胞质中,不能由cryoET来解决。这种取向留下的ROC GTP酶结构域面向所述微管的表面,并暴露于胞质溶胶的激酶(参见下图)。结构建模表明激酶是在封闭的构象,虽然这个细节不能被直观地解决。

双二聚。两个LRRK2单体(左)通过其COR域(黄色)坐在一个微管(轮廓)链路上,留下暴露于细胞质的激酶(粉红色)。其WD40域(红色),链接到相邻的单体(灰色)。旋转,以显示沿微管轴(右)暴露出GTP酶域(绿色)坐落对微管表面上的视图。[礼貌Watanabe等人,Cell的。]

比利亚认为使用cryoET到扫描分子内的细胞可能有助于破解其他顽抗结构,疾病期间以及提供线索,什么样蛋白在做他们的母语环境,以及如何改变她的小组的做法。“这桥的结构和细胞生物学的一个新时代的开始,”比利亚说。

密切接触。LRRK2的C-末端半折叠,以使其激酶(橙色)和GTP酶(绿色)到接近。常见的帕金森氏突变占尽天时地利,修改此接触(右)。[礼貌Deniston等人,自然。]

LRRK2的业务最终的高分辨率掠影
对他们来说,Leschziner,相应的合着者萨马拉Reck的彼得森和他的同事采取了不同的方法。共同第一作者塞巴斯蒂安Mathea在斯特凡·纳普公司在法兰克福歌德大学的实验室已经表示在昆虫细胞中野生型人LRRK2的C末端的一半,并发现它是易于纯化。共同第一作者Colin Deniston通过cryoEM成像这些分子以3.5埃的分辨率。他们确定,折叠成带来的ROC GTP酶与激酶结构域紧密接触的J形的分子(见上面的图像)。以前的研究已经发现,GTP酶活性是为激酶功能是必需的,但不清楚这些领域如何相互作用(伊藤等人,2007年;West等人,2007)。在该蛋白片段,所述激酶假定其打开,催化失活的形状。

有趣的是,WD40结构域的C末端尾部形成的长α螺旋沿着激酶的骨干延伸,在几个点与它进行交互。他指出,这个α螺旋包含至少一个磷酸化位点,Leschziner推测这尾可能会帮助该修改调节激酶的形状,或许其导通和关断。

最后,研究人员覆盖他们的模型到由比利亚和他的同事描述的LRRK2细丝,看是否匹配结构。单体配合相对较好,但不是完全-的COR域发生冲突对那些相邻LRRK2s的。当Leschziner和他的同事改变了他们的结构,一个封闭的激酶域模型,但是,这些立体冲突解决(见下图)。这一发现表明,该激酶的开放构象可以防止微管结合,Leschziner说。

怎么做微管适应?
是否LRRK2 gloms到生理条件下微管还不清楚。在含有内源性,野生型LRRK2培养的细胞,所述蛋白质是没有明显的微管,维拉指出。然而,当野生型LRRK2被过度表达,它形成于微管细丝。此外,六个最常见的PD突变,I2020T,N1437H,R1441G,R1441C和五Y1699C,促进LRRK2长丝形成。

所有这些突变的增压激酶活性,这将迫使激酶到其闭合的形状。I2020T坐在激酶结构域的活化环,G2019S,最常见的致病LRRK2突变之后,另外三个是在它们将被定位到之间ALTER通信的GTP酶和COR-B结构域之间的界面激酶和GTP酶(见上述图像)。“看来,如果你强行LRRK2进入活动状态,它结合微管,”比利亚说。

打开和关闭。在开放构象激酶(左)中,LRRK2单体配合不佳入灯丝的结构。凭借其激酶(橙色)关闭(右),其卡入到位。[礼貌Deniston等人,自然。]

雷克 - 彼得森的数据表明,微管结合可能导致问题。共同第一作者John Salogiannis结合LRRK2,微管,马达蛋白驱动蛋白和动力蛋白在无细胞测定。马达蛋白正常“走”沿着微管,运送货物向股正负两端,分别。但是,LRRK2的甚至低纳摩尔量缩短了电机能走路的距离。在25纳米LRRK2,电机陷于停顿,无法步过在他们的道路螺旋LRRK2股。

没有人知道,如果这路障服务的目的,但Leschziner指出,LRRK2被称为磷酸化Rab蛋白的一个子集,装饰囊泡由马达蛋白沿着微管运输。可能的话,瞬时LRRK2低聚物的微管结合可以暂停电机足够长的激酶磷酸化的RAB和改变货物运输得到什么。

这到底意味着什么的治疗?
关于微管结合问题,可以将相关的PD治疗的发展。I型激酶抑制剂阱在其闭合状态下的酶,同时保持它不活动通过阻止其结合ATP。难道I型LRRK2抑制剂促进微管结合?Deniston等人的数据显示为多,至少在无细胞试验。研究人员补充I型抑制剂MLI-2到其测定与LRRK2沿,发现抑制剂进一步阻碍沿着微管马达蛋白的移动。MLI-2是一个制药工具,而不是在开发的药物(Fell等人,2015年;Scott等人,2017年)。相反,II型抑制剂,包括所述Bcr-Abl激酶抑制剂GZD-824,其稳定的开放激酶构象,释放马达再次移动。

马克·库克森在国家老年研究所,马里兰州贝塞斯达指出,这一发现可能有助于解释明显的矛盾是LRRK2激酶抑制剂增强细丝在细胞内形成,正如致病突变PD做。“考虑到在LRRK2基因突变是增益的功能时,这是特别令人费解,我们已经想到激酶抑制剂的潜在治疗,”库克森写道(低于满注释)。

“这些数据提供了进一步的深入了解LRRK2的另一个潜在的病理机制,或许可以解释某些LRRK2抑制剂的一些对靶毒性,但需要更多的研究,”安德鲁Koemeter - 考克斯在迈克尔J. Fox基金会写信给Alzforum(全下面评论)。同样,阿莱西建议调查II型抑制剂是否有副作用较少。

迪纳利治疗有两个LRRK2抑制剂,DNL201DNL151在第一阶段试验。他们都认为是I型目前还没有人开发LRRK2选择性II型抑制剂,阿莱西说。

更神秘
科学家正在寻求其他LRRK2谜语。Leschziner和雷克 - 彼得森对其他突变体的结构将目光。奇怪的是,到目前为止G2019S还没有被证明能增加LRRK2在细胞微管结合。像其他致病突变的PD,则会开启激酶。但是,与他们不同,G2019S不增加细胞拉布磷酸化。“G2019S可能比其他人不同的机械方式有助于疾病,” Leschziner建议。

探讨LRRK2的生理作用,比利亚将研究PD相关的细胞类型,例如多巴胺能神经元和神经胶质细胞的内源性LRRK2。在细胞中,蛋白质更经常发现有隔膜比微管相关。是否采取不同的形状,当它结合膜?别墅将招募LRRK2在细胞培养膜,并与质谱结合cryoET,以确定其结构和相互作用的合作伙伴。

淮滨蔡在NIA认为,发现这些互动的合作伙伴是破译蛋白质做什么至关重要。“未来的研究将需要确定调节LRRK2的构象变化在不同亚细胞区室激酶结构域的信号级联反应,以及确定任何特定货物停止和LRRK2修改,”他写信给Alzforum(低于满注释)。-Madolyn鲍曼罗杰斯

注释

  1. 这两篇论文大幅增加我们的LRRK2,到目前为止已经在很大程度上被基于蛋白质的小片段的结构知识。现场识别潜在的结构是特别有帮助,并改善与其他技术的分辨率增加了见解。

    我认为最重要的启示是在观念上的相对开放与封闭激酶结构可驱动ROC-COR双域如何定位。也就是说LRRK2可以与微管相关联已经在文献中很长一段时间(格雷焦等人,2006年;凯特等人,2012),但是奇怪的观察一直是一些突变,尤其I2020T和GTP酶缺陷型R1441和Y1699突变,往往表现出丝状染色而激酶抑制剂也显示出相同的(Dzamko等人,2010)。这是考虑到在LRRK2基因突变是增益的功能,我们已经想到激酶抑制剂的潜在治疗时特别令人费解。使得通过对GTP结合区域传播表明,细丝形成激酶抑制剂能唤起激酶结构域的开放或闭合构象的澄清是唯一的在LRRK2的各种域会发生什么的间接度量,从直接测量激酶或GTP酶功能不同。

    澄清,仍然很重要的一个方面是是否存在在细胞LRRK2的另外的结构形式,特别是那些与细胞膜相关联。再次,从LRRK2生物学初期文献在超过细胞骨架元件细胞内膜显示定位(港-Abarrategui等人,2009年),这东西已经在最近几年与识别的Rab蛋白作为LRRK2功能的下游效应一定程度上重新发现。真正的问题,因此,在当前的文件结构上定义的微管关联是否表示次要的,但是潜在的重要,LRRK2的分数在细胞和是否在其他区室的蛋白质具有相似的结构。因此这将是关键的扩展这些技术来检查与各种膜结合细胞器相关联的LRRK2。

    参考文献:

    LRRK2调节自体吞噬活性,定位于特定的膜微在一个新的人类基因组记者细胞模型坎分子遗传学。2009年11月1日; 18(21):4022-34。考研

    LRRK2的抑制激酶活性的引线成Ser(910)/丝氨酸(935)的14-3-3结合中断的去磷酸化和改变的细胞质定位生物化学杂志。2010年9月15日; 430(3):405-13。考研

    激酶活性所需的突变体LRRK2 / dardarin的毒性作用神经生物学派息。2006年8月; 23(2):329-41。考研

    LRRK2帕金森病的突变增强其微管协会坎分子遗传学。2012 2月15日; 21(4):890-9。电子版2011年11月11考研

  2. 在这两个优雅的研究中所描述的新的结构在我们的LRRK2的理解代表了一种显著的一步。这些数据提供新的见解如何致病突变可能发挥促进LRRK2采取封闭构象是能结合微管细丝它们的影响。作者在生化分析令人信服地表明,LRRK2沿长丝行进微管结合块基于微管驱动蛋白电机。

    在今后的工作中,将建立内源性LRRK2基因突变轴承是重要的原因帕金森氏也结合微管,会干扰微管动力和地址,这是否是由LRRK2链接到帕金森氏机制。据我所知,在封闭微管所有广泛使用的LRRK2抑制剂陷阱LRRK2结合构象。因此,LRRK2抑制剂的施用诱导闭合构象可诱导LRRK2结合到微管,并导致不希望的效果。因此,这将是有趣的,开发一类新的LRRK2抑制剂,在开放的,非微管陷阱LRRK2结合构象。这应该是可能的和类激酶抑制剂的称为“II型”已经被其他蛋白激酶的发展。然后,它将以比较LRRK2抑制剂和测试的这两个类处理细胞如果II型抑制剂使得在打开的非微管陷阱LRRK2结合构象的施用具有降低的副作用的影响是重要的。

  3. LRRK2的与微管的相互作用是在不断的努力最早的观测来理解这个大帕金森病(PD)的生物学功能 - 相关多域蛋白质之一。内存仍然在我们的斗争在我脑海中生动的讲解,在2009年发表的一篇论文,为何PD相关G2019S突变LRRK2蛋白的存在促进和组装稳定微管,而不是微管网的破坏,一个共同的致病机制与许多其他疾病相关的基因突变。十多年后,这两款优雅文章由细胞发布回到后端与自然提供了新的结构细节和功能的见解LRRK2和微管共装配通过Cryo-EM和subtomogram分析。

    渡边,并在其细胞纸同事证明LRRK2蛋白低聚在培养的细胞周围的微管束。Deniston等。在它们的自然纸进一步提供LRRK2和微管关联的原子模型。他们特别突出的构象变化,即,打开/未激活与封闭/活性,的LRRK2调节LRRK2的微管低聚激酶结构域。封闭的构造有利于围绕微管LRRK2聚合物的关联,同时开启形态disfavors它。此外,他们发现,I型LRRK2激酶抑制剂促进闭合构象,但类型II抑制剂稳定开结构,这表明不同类型的LRRK2的激酶抑制剂可产生对抗的结果。在支持体的LRRK2微管相互作用的功能意义,Deniston等。表明,LRRK2的聚合物的附着围绕微管块中的驱动蛋白和动力蛋白马达蛋白介导的货物运输。但是,LRRK2可能不只是充当路障。例如,微管通过LRRK2的包覆可拆装妨碍动态微管网络的和微管侧链的修饰干扰。

    未来的研究将需要确定调节LRRK2的构象变化在不同亚细胞区室激酶结构域的信号级联反应,以及确定任何特定货物停止和LRRK2修改。

  4. LRRK2的RCKW域的高分辨率结构是我们的蛋白质的理解,以及如何它的域可能相互作用来调节功能的巨大飞跃。此数据提供关于LRRK2的另一种潜在的病理机制进一步了解,并且可以解释某些LRRK2抑制剂的一些上靶毒性。不过,需要更多的研究。

    这一突破给了我们希望,LRRK2的更高分辨率的结构,可以实现以帮助改善LRRK2抑制剂的设计。这也验证了迈克尔·J·福克斯基金会的办法来解决油田范围的挑战。我们资助了这些研究,因为我们还有其他的大型合作,以去除路障的生物的认识和治疗开发,帕金森氏病。

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参考

Alzpedia引文

  1. 富含亮氨酸重复激酶2(LRRK2)

新闻引文

  1. LRRK2面面观
  2. LRRK看守人眼光转向炎症,自体吞噬激酶

治疗引文

  1. DNL201
  2. DNL151

论文引用

  1. LRRK2激活原发性帕金森病科学译医学。2018 7月25日; 10(451)考研
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  3. GTP结合是LRRK2,家族性帕金森氏症的致病基因产物的蛋白激酶活性所必需的生物化学。2007年2月6日; 46(5):1380-8。考研
  4. 在LRRK2链接帕金森氏症相关的基因突变增强GTP结合和激酶活动的神经毒性坎分子遗传学。2007年1月15; 16(2):223-32。考研
  5. MLI-2,用于探索的治疗潜力LRRK2激酶抑制的安全和有效的,选择性,和中枢活性化合物Ĵ药理学精通THER。2015年12月; 355(3):397-409。EPUB 2015年9月25日考研
  6. 的发现3-(4-嘧啶基)吲唑(MLI-2),可口服和选择性富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)抑制剂,降低脑激酶活性医学杂志化学。2017年04月13; 60(7):2983至2992年。EPUB 2017年03月16日考研

延伸阅读

主要论文

  1. 帕金森氏病相关LRRK2的原位结构细胞。2020年08月07;考研
  2. 微管相互作用在帕金森氏病LRRK2的结构和模型性质。2020年08月19;考研